25-Hydroxycholecalciferol ist ein biologisch weniger aktiver Metabolit des Cholecalciferols oder des Vitamins D3 und wird durch weitere Hydroxylierung zum aktiven 1,25-Dihydroxycholecalciferol.

Cholecalciferol entsteht in der Haut unter Einwirkung von UV-Strahlen durch Spaltung des 7-Dehydrocholesterins und wird in der Leber durch Hydroxylierung zum 25-Hydroxycholecalciferol. Das biologisch weniger aktive 25-Hydroxycholecalciferol wird durch weitere Hydroxylierung in der Niere zum aktiveren 1,25-Dihydroxycholecalciferol (oder auch 1,25-(OH)2-Vitamin-D3). Diese Substanz stimuliert im Knochen die Mineralisierung, also die Einlagerung von Hydroxylapatit in das Osteoid. Im Darm wird die Resorption von Kalzium und Phosphat angeregt. Ein Mangel an Vitamin D3 (D-Avitaminose) kann durch fehlende UV-Strahlung und fehlende Vitamin-D-Zufuhr entstehen.